Клеточные трансформирующие гены

довательностями, причем каждый последующий цикл трансфекции значительно повышал эффективность трансформации клеток NIH ЗТЗ препаратом ДНК (препараты ДНК брали из фокусов трансформации последовательных циклов трансфекции). С помощью молекулярного клонирования в бактериофаге, где в качестве «зонда» использовались Alu-последовательности, присутствующие в качестве вставки в pBR-322 (проба BLUR-8), и последующего реклонирования ВатН I фрагмента размером 6,6 т. п. о. в плазмиде pBR-322 трансформирующий ген был получен в «чистом виде». Последующий сравнительный анализ и сопоставление плазмид, несущих онкоген pEJ-6,6, а также онкоген рТ24, с уже известными вирусными онкогенами, позволили установить, что обнаруженные и изолированные человеческие онкогены принадлежат к типу трансформирующих генов, родственных c-Ha-ras 1 [Goldfarb M. et al. , 1982; Parada L. et al. , 1982; Taparowsky E. et al. , 1982).

Полностью генетический локус протоонкогена c-Ha-ras I (вирусспецифическая область, комплементарная v-Ha-ras-онко-гену) в донорских препаратах ДНК, а также первичных и вторичных трансформантах представлен рестрикционным Sac I-фрагментом размером 2,9 т. п. о. [Goldfarb M. et al. , 1982; Reddy Е. et al. , 1982J. При этом генетический локус c-Ha-ras 2 протоонкогена может быть выявлен в Sac 1-фрагменте размером 21,0 т. п. о. в «мягких» условиях гибридизации [Chang E.
et al. , 1982J.

Методом А. Махат и W. Gilbert (1977) были определены нуклеотидные последовательности онкогена Т24 [Reddy E. , 1983J, в последующем методом гетеродуплексного анализа — генетическая структура этого гена [Capon D. et al. , 1983]. В нем были идентифицированы 4 кодирующие области (экзоны), которые разобщены тремя некодирующими последовательностями нуклео-тидов — интронами [Ellis R. et al. , 1980]. Каждая кодирующая область гена c-Ha-ras 1 рака мочевого пузыря человека содержит сигналы для сплайсинга иРНК онкогена, а на З'-конце 4-го экзона имеет терминирующий кодон функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы и сигнал полиаденирования иРНК [Chang E. et al. , 1982; Reddy E. et al. , 1982, 1984]. Клонированный из ДНК клеточной линии Т24 онкоген c-Ha-ras I трансформировал клетки NIH ЗТЗ с высокой эффективностью, в то время как его нормальная аллель из нормальных клеток плаценты человека в параллельных экспериментах по трансфекции была неактивна.

Лигирование протоонкогена c-Ha-ras 1 с сильным промотером также не приводило к его активированию, т. е. способности трансформировать клетки N1H ЗТЗ. По данным молекулярной гибридизации, трансфецированный протоонкоген c-Ha-ras 1 интегрировался в геном реципиентных клеток, при этом уровень экспрессии химерной структуры — протоонкогена с LTR — существенно возрастал. Эти эксперименты косвенно свидетельствовали о том, что активация онкогена ras не связана с повышением уровня